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文章分享丨MIRA結(jié)合CRISPR雙靶標(biāo)基因檢測(cè)
《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》 轉(zhuǎn)基因作物已在世界各地廣泛種植，許多國(guó)家逐步完善轉(zhuǎn)基因監(jiān)管措施以確保轉(zhuǎn)基因作物的安全。開發(fā)快速和準(zhǔn)確的基因現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法對(duì)農(nóng)業(yè)和生物安全非常重要，可以減輕公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的擔(dān)心。 在本研究中，課題組開發(fā)了一種新的一鍋法反應(yīng)——雙重MIRA檢測(cè)結(jié)合雙重CRISPR（MR-DCA方法），用于同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中的CaMV35S和NOS遺傳靶點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單高效的檢測(cè)方法。 實(shí)驗(yàn)方法 將雙重MIRA產(chǎn)物用雙Cas13a、Cas12a系統(tǒng)進(jìn)行分析，產(chǎn)生兩個(gè)互不干擾的獨(dú)立信號(hào)，再通過照明儀器讀取熒光顏色，或通過帶有兩條T線的試紙條，以實(shí)現(xiàn)雙通道讀出。整個(gè)過程在不到35 min的時(shí)間內(nèi)完成，檢測(cè)限低至20個(gè)拷貝。
（MR-DCA檢測(cè)CaMV35S和NOS的原理） 整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)步驟：MIRA擴(kuò)增、CRISPR反應(yīng)、2種方式的結(jié)果判讀。 CaMV35S基因作為Cas13a的靶標(biāo)，NOS基因作為Cas12a的靶標(biāo)，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)MIRA引物。Cas13a系統(tǒng)只識(shí)別RNA，因此設(shè)計(jì)了正向引物區(qū)域，包含一個(gè)T7啟動(dòng)子，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄，激活Cas13a。為NOS基因增加一個(gè)PAM 。以上的這些的添加確保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以與各自的crRNA結(jié)合，且兩個(gè)系統(tǒng)之間不存在干擾或交叉反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)情況 l 靈敏度和特異性 將樣本梯度稀釋來測(cè)試MIRA反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)樣本濃度在20μL時(shí)仍能檢測(cè)到熒光強(qiáng)度，最終實(shí)驗(yàn)選定20μL的濃度。
（不同樣本濃度和試紙條顯色測(cè)試并用強(qiáng)度量化計(jì)算） 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)MR-DCA的特異性，課題組對(duì)非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物混合樣品和非轉(zhuǎn)基因植物混合樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示只有含有CaMV35S和NOS的轉(zhuǎn)基因樣品具有較高的熒光信號(hào)，而其他樣品的熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照比較接近。MR-DCA可作為一種特定的雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)平臺(tái)。 用MR-DCA對(duì)24個(gè)作物樣品進(jìn)行了測(cè)試。 其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因玉米。7、8、23、24是含有NOS終止子的抗病轉(zhuǎn)基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子轉(zhuǎn)基因大豆。
（24個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果） l反應(yīng)快速 反應(yīng)時(shí)間是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一個(gè)重要因素，課題組觀察到在反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，就已經(jīng)能用熒光儀檢測(cè)到FAM和HEX的熒光信號(hào)。MIRA結(jié)合CRISPR反應(yīng)，也在15min后觀察到黃色熒光。
（不同MIRA反應(yīng)時(shí)間下的熒光信號(hào)）
（MIRA反應(yīng)不同時(shí)間下的試紙條顯色并用強(qiáng)度量化計(jì)算） l 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該雙重MIRA具有良好的特異性，并能準(zhǔn)確地獲得CaMV35S和NOS的擴(kuò)增產(chǎn)物，Cas13a和Cas12a系統(tǒng)獨(dú)立反應(yīng)，互不干擾。MR-DCA檢測(cè)能在35min的低溫下準(zhǔn)確檢測(cè)到20個(gè)拷貝，具有在田間檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的巨大價(jià)值。
文章信息 期刊名稱：《Journal of Advanced Research》 文章標(biāo)題：《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》 影響因子：11.4 研究團(tuán)隊(duì)：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院汪小福 原文鏈接：
安普未來多酶恒溫快速核酸擴(kuò)增技術(shù)MIRA技術(shù)在恒溫39°C-42°C下核酸擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間僅為5-20 min。此外，不需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件，應(yīng)用場(chǎng)景多元化：綜合醫(yī)院檢驗(yàn)科、基層醫(yī)療、居家檢測(cè)、田間地頭等。 試劑產(chǎn)品形態(tài)多樣化：凍干粉、凍干微球等；顯示結(jié)果的多樣性：凝膠電泳、熒光曲線、膠體金試紙條等。試劑性能穩(wěn)定、便于操作、方便存儲(chǔ)運(yùn)輸。 并以MIRA為核心平臺(tái)技術(shù)研發(fā)出“超快速核酸釋放技術(shù)”、“雙通道恒溫熒光檢測(cè)儀”、“一體化全自動(dòng)封閉檢測(cè)系統(tǒng)”、“自測(cè)型核酸檢測(cè)裝置”等一系列配套產(chǎn)品，打造快速分子檢測(cè)整體解決方案。 點(diǎn)擊：閱讀原文 |
