溶血葡萄球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性凝固酶陰性細(xì)菌，在醫(yī)院中非常常見(jiàn)。近年來(lái)由于醫(yī)院獲得性感染的風(fēng)險(xiǎn)較高，受到越來(lái)越多的關(guān)注。溶血葡萄球菌可進(jìn)一步導(dǎo)致皮膚感染、腦膜炎、腹膜炎，甚至敗血癥。臨床診斷的延遲會(huì)導(dǎo)致健康狀況的惡化，因此快速診斷溶血葡萄球菌是精確治療的關(guān)鍵。

中國(guó)連云港市第二人民醫(yī)院中央實(shí)驗(yàn)室科的季拓老師課題組，在《Analytica Chimica Acta》期刊上發(fā)表文章《A rapid and visual detection of Staphylococcus haemolyticus in clinical specimens with MIRA-LFS》，影響因子6.2。

1.研究概述

在該研究中，建立了一種基于mvaA基因的MIRA-LFS檢測(cè)溶血葡萄球菌的方法，使用多酶恒溫快速核酸擴(kuò)增技術(shù)MIRA與側(cè)流試紙條LFS結(jié)合，實(shí)現(xiàn)快速病原體檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)在37℃下進(jìn)行，可在9min內(nèi)檢測(cè)到結(jié)果，檢測(cè)靈敏度為0.147CFU/反應(yīng)。

MIRA-LFS檢測(cè)方法適用于臨床樣本中溶血葡萄球菌的定點(diǎn)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了POCT鑒別溶血葡萄球菌的方法，對(duì)醫(yī)療服務(wù)不足地區(qū)的快速疾病診斷和治療具有重要價(jià)值。

課題組用MIRA-LFS、qPCR和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法對(duì)95個(gè)隨機(jī)臨床樣本進(jìn)行分析，證實(shí)了臨床適用性。

2.研究方法

MIRA-LFS檢測(cè)示意圖如上所示。

研究使用了安普未來(lái)生物的DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）、核酸檢測(cè)試紙條。

mvaA基因引物長(zhǎng)度為30-35個(gè)核苷酸，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-350bp，共設(shè)計(jì)6對(duì)候選引物。利用標(biāo)準(zhǔn)溶血葡萄球菌菌株的gDNA進(jìn)行MIRA分析，篩選候選引物，用2%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物。

（使用瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物）

再根據(jù)正向引物序列（向后延伸16bp）設(shè)計(jì)探針。探針的5’端用FITC標(biāo)記，3’端標(biāo)記C3阻斷。利用THF替換探針中31位的核苷酸，THF距離5’端30bp，距離3’端15bp。所選的反向引物的5’端用生物素進(jìn)行標(biāo)記。

（引物探針組合的交叉二聚體和序列修飾示意圖）

并且，課題組優(yōu)化了溶血葡萄球菌MIRA-LFS檢測(cè)的反應(yīng)條件。在37℃下，從4-12min每間隔2min進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示在8min反應(yīng)時(shí)間，試驗(yàn)線清晰可見(jiàn)。另外，從22-52℃，每間隔5℃進(jìn)行測(cè)試。37-42℃是最適合MIRA-LFS檢測(cè)的溫度。因此，溶血葡萄球菌MIRA-LFS法的最佳反應(yīng)時(shí)間和溫度，分別為8min和37℃。加上最終結(jié)果在1min內(nèi)通過(guò)LFS可視化，總檢測(cè)時(shí)間為9min。

（反應(yīng)時(shí)間、溫度的優(yōu)化）

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 靈敏度驗(yàn)證

從連續(xù)稀釋的溶血葡萄球菌培養(yǎng)物（10^6-10^0CFU/mL）中獲得的不同濃度的基因組DNA（gDNA）進(jìn)行MIRA-LFS檢測(cè)。

（不同濃度下的陽(yáng)性信號(hào)）

通過(guò)概率單位回歸分析顯示，MIRA-LFS檢測(cè)法測(cè)定的95% LOD為0.147CFU/反應(yīng)。

（檢測(cè)限計(jì)算）

2. 特異性驗(yàn)證

通過(guò)分析18株常見(jiàn)的致病微生物菌株和15株臨床溶血葡萄球菌菌株，測(cè)定了溶血葡萄球菌MIRA-LFS檢測(cè)的選擇性。結(jié)果顯示，MIRA-LFS檢測(cè)對(duì)其他18種致病菌均為陰性，對(duì)15個(gè)已驗(yàn)證的溶血葡萄球菌臨床樣本均呈陽(yáng)性。

（分別檢測(cè)8株標(biāo)準(zhǔn)致病菌菌株、15株臨床溶血性鏈球菌菌株）

MIRA-LFS檢測(cè)具有高選擇性，適合溶血葡萄球菌的篩選。

3.實(shí)際樣本檢測(cè)

連云港第二人民醫(yī)院隨機(jī)采集的95份標(biāo)本，包含皮膚軟組織35份、尿液16份、痰14份和血液30份樣本。

（不同方法檢測(cè)95例臨床標(biāo)本）

結(jié)果表明，該檢測(cè)方法與qPCR法符合度達(dá)100%。此外，與金標(biāo)準(zhǔn)（GB/T4789.11-2003）相比，MIRA-LFS檢測(cè)方法鑒定溶血葡萄球菌感染的靈敏度和特異性分別為100%和98.73%。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法在檢測(cè)臨床樣本中溶血葡萄球菌的技術(shù)可行性。

MIRA-LFS方法用于快速POCT檢測(cè)溶血葡萄球菌，具備高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)成本低的特性，有助于快速做出診斷和治療決策。

了解MIRA技術(shù)

安普未來(lái)多酶恒溫快速核酸擴(kuò)增技術(shù)MIRA技術(shù)在恒溫39°C-42°C下核酸擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間僅為5-20 min。此外，不需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件，應(yīng)用場(chǎng)景多元化：綜合醫(yī)院檢驗(yàn)科、基層醫(yī)療、居家檢測(cè)、田間地頭等。

試劑產(chǎn)品形態(tài)多樣化：凍干粉、凍干微球等；顯示結(jié)果的多樣性：凝膠電泳、熒光曲線、膠體金試紙條等。試劑性能穩(wěn)定、便于操作、方便存儲(chǔ)運(yùn)輸。

并以MIRA為核心平臺(tái)技術(shù)研發(fā)出“超快速核酸釋放技術(shù)”、“雙通道恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀”、“一體化全自動(dòng)封閉檢測(cè)系統(tǒng)”、“自測(cè)型核酸檢測(cè)裝置”等一系列配套產(chǎn)品，打造快速分子檢測(cè)整體解決方案。