近日美國(guó)密西西比州立大學(xué)海岸研究和推廣中心的Park教授發(fā)表了文章《Development of Multienzyme Isothermal Rapid Amplification (MIRA) Combined with Lateral-Flow Dipstick (LFD) Assay to Detect Species-Specific tlh and Pathogenic trh and tdh Genes of Vibrio parahaemolyticus》，收錄在SCI期刊《Pathogens》。實(shí)驗(yàn)中建立了一種MIRA-LFD檢測(cè)副溶血性弧菌快速、簡(jiǎn)單的方法。在資源有限的田間條件下，不僅能快速檢測(cè)副溶血性弧菌的tlh基因，還能快速檢測(cè)該基因的兩個(gè)致病性trh和tdh基因。

副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性的嗜鹽細(xì)菌，生活在世界范圍內(nèi)溫暖的河口和海洋環(huán)境中。它是重要的食源性致病菌之一，通常發(fā)生在人們?cè)谑秤檬芪廴镜纳���、未煮熟的海鮮后。美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心估計(jì)，在美國(guó)約有84,000人因弧菌感染而遭受食源性疾病。

副溶血性弧菌的trh基因編碼的耐熱相關(guān)溶血素和tdh基因編碼的耐熱直接溶血素，已被認(rèn)為是副溶血性弧菌誘導(dǎo)的胃腸炎致病性的關(guān)鍵指標(biāo)。并且tlh基因編碼耐熱性溶血素大多數(shù)毒力分離株顯示trh和/或tdh陽(yáng)性。

實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)中分別將正向、反向引物和探針加入到MIRA試劑，在40◦C下孵育15 min進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。再用羧基熒光素（FAM）和抗原標(biāo)記（生物素）標(biāo)記，將MIRA產(chǎn)物用雜交檢測(cè)緩沖液稀釋。將LFD的樣品墊浸泡在稀釋后的溶液中，室溫下孵育2 min，觀察條帶顯色。同時(shí)采用qPCR、PCR方法做了實(shí)驗(yàn)對(duì)比，驗(yàn)證MIRA-LFD靈敏度。

（MIRA-LFD檢測(cè)tlh、tdh和trh基因工作流程）

靈敏度：

（分別使用MIRA-LFD、qPCR、PCR檢測(cè)gDNA樣本和細(xì)菌培養(yǎng)樣本）

實(shí)驗(yàn)使用了4個(gè)10倍連續(xù)稀釋的樣本，從1 pg到1 fg分別做了檢測(cè)；細(xì)菌培養(yǎng)樣本從2×10³ CFU到2 CFU。

MIRA-LFD對(duì)tlh、tdh和trh基因的檢測(cè)結(jié)果分別為10 fg、細(xì)菌培養(yǎng)2 CFU。

特異性：

利用副溶血性弧菌和其他食源性致病菌的基因組DNA評(píng)估MIRA-LFD的特異性，MIRA-LFD檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照副溶血性弧菌F11-3A的tlh、trh和tdh基因的檢測(cè)品系呈陽(yáng)性，其他則顯示陰性。

MIRA-LFD對(duì)靶基因具有高度特異性，但與其他密切相關(guān)的細(xì)菌沒(méi)有交叉反應(yīng)。

（MIRA-LFD檢測(cè)副溶血性弧菌及其他弧菌和食源性致病菌）

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)MIRA-LFD檢測(cè)準(zhǔn)確擴(kuò)增基因的靶區(qū)，并在20 min內(nèi)提供檢測(cè)結(jié)果�？蓹z測(cè)到低至10 pg的gDNA和2 CFU的副溶血性弧菌，具有較高的特異性

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